西紅柿是研究更年期成熟的肉質(zhì)水果的模型。番茄成熟不僅受到植物激素乙烯及其下游效應(yīng)基因的控制，還受到多種轉(zhuǎn)錄因子的控制。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子APETALA2a (AP2a)、不成熟(NOR) 和果實(shí)豐滿度是控制番茄果實(shí)成熟的主要調(diào)節(jié)因子。他們提出的功能源于對(duì)自然發(fā)生的突變體或RNAi 敲低菌株的表型研究，而不是目前出現(xiàn)的實(shí)際無效突變體。為了更詳細(xì)地研究轉(zhuǎn)錄因子在番茄果實(shí)成熟中的功能，我們使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的誘變來敲除編碼基因，并首次報(bào)告了這些突變體的表型。雖然觀察到ap2a 突變體具有早熟、橙色成熟的表型，但無效突變體表現(xiàn)出比天然突變體溫和得多的表型。進(jìn)一步分析表明，自然發(fā)生的變異的嚴(yán)重表型是由顯性失活等位基因引起的。我們的方法還為FUL1 和FUL2 的獨(dú)立和重疊功能提供了新的見解。 FUL1 和FUL2 的單個(gè)無效等位基因和組合無效等位基因表明這兩個(gè)基因在果實(shí)成熟中具有部分冗余功能，但在果實(shí)早期發(fā)育中沒有。FUL2 的進(jìn)一步作用也被揭示。

AP2A 突變體果實(shí)開始較早成熟，但未完全成熟。據(jù)報(bào)道，基于RNAi 12 的表達(dá)抑制，AP2a 是番茄果實(shí)成熟開始的負(fù)調(diào)節(jié)因子，但迄今為止尚不存在真正的敲除突變體。編碼的401 個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)包含兩個(gè)被認(rèn)為參與DNA 結(jié)合的AP2 結(jié)構(gòu)域，并且使用兩個(gè)gRNA 可以創(chuàng)建兩個(gè)相反的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)外顯子的第一部分被刪除。得到9。我們選擇了最有可能是空等位基因的兩個(gè)刪除的行。在ap1a-cr35 中，連接兩個(gè)gRNA 靶位點(diǎn)的27 bp 缺失預(yù)計(jì)會(huì)生成沒有AP133 結(jié)構(gòu)域的2 個(gè)aa 肽，而ap2a-cr2 等位基因中的67 bp 缺失由于核苷酸向上游延伸至起始密碼子，因此不會(huì)產(chǎn)生預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生AP1a 蛋白。

盡管ap2a-cr2中的5 bp缺失延伸至AP2a的12'UTR，但這并不一定影響其轉(zhuǎn)錄。該突變刪除了第一個(gè)起始密碼子和第204 位氨基酸的另一個(gè)起始密碼子。氨基酸位置5 處的下一個(gè)框內(nèi)起始密碼子位于兩個(gè)保守的AP3 結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的第一個(gè)外顯子2 中，因此它的使用不太可能產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。與野生型果實(shí)相比，兩個(gè)品系的果皮在破殼期20天后仍保持橙色/棕色，并且沒有完全變紅。更快的成熟伴隨著更快的老化。 ap2a-cr1 和ap2a-cr2 的果實(shí)在60 DPA 之前開始破裂，而其他突變體的果實(shí)保持完整。 ap2a突變體的果實(shí)ap39a-cr41和ap2a-cr1僅需2-2天即可達(dá)到Br階段，明顯短于野生型果實(shí)。這與7 天前觀察到的RNAi 果實(shí)的顏色變化一致。證實(shí)了AP2a 在番茄果實(shí)成熟啟動(dòng)中的負(fù)調(diào)節(jié)作用。兩種ap2 敲除突變體的果實(shí)在Br 階段產(chǎn)生的乙烯至少是野生型的兩倍。

已知擬南芥AP2 蛋白通過反饋控制負(fù)調(diào)節(jié)其自身轉(zhuǎn)錄。盡管RNAi 敲低表達(dá)通常會(huì)降低靶基因的mRNA 水平，但剩余的mRNA 仍然可以產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。除了提供更強(qiáng)的表型之外，不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)的突變體還允許探索蛋白質(zhì)自身表達(dá)的正反饋或負(fù)反饋?zhàn)詣?dòng)調(diào)節(jié)。這通過野生型果實(shí)和ap2a-cr1 和-cr2 果實(shí)中番茄AP2a mRNA 的表達(dá)分析得到了證明。由于這種突變沒有產(chǎn)生功能性蛋白，因此突變果實(shí)表現(xiàn)出更高水平的AP2a mRNA，表明番茄AP2a蛋白負(fù)向調(diào)節(jié)其自身轉(zhuǎn)錄，類似于擬南芥AP2已被證明。 ap2a-cr1和ap2a-cr2產(chǎn)生更多的乙烯并且成熟得更快，證實(shí)了AP2a在乙烯產(chǎn)生和番茄果實(shí)成熟啟動(dòng)中的負(fù)面作用。由于缺乏番茄紅素產(chǎn)生和葉綠素降解缺陷而導(dǎo)致的橙色/棕色果實(shí)顏色揭示了成熟中的積極調(diào)節(jié)作用，與Karlova 等人的RNAi 表型一致。

非無效突變體的表型高于天然存在的非突變體，自發(fā)或突變體中的成熟缺陷是由NAC-NOR的第三外顯子（Solyc2g10）006880 bp缺失引起的移碼和與完整基因的355 個(gè)氨基酸相比，截短的蛋白質(zhì)為186 個(gè)氨基酸(aa)，并且該截短的部分位于NAC 結(jié)構(gòu)域之后，并且截短的蛋白質(zhì)仍然有可能保留二聚化和結(jié)合DNA 的能力。請(qǐng)從您的簡(jiǎn)歷中刪除NOR。 Moneyberg：我們?yōu)镹AC-NOR設(shè)計(jì)了兩個(gè)gRNA，但在T6位置沒有發(fā)現(xiàn)編輯。獲得了NAC 結(jié)構(gòu)域編碼序列5' 的兩個(gè)等位基因，即在位置t1 處具有1 bp 刪除的nor-cr1 和具有2 bp 刪除的nor-cr3。兩者都會(huì)導(dǎo)致移碼，并且蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)僅包括NAC-NOR 的17 個(gè)氨基酸，而不包括保守的NAC 結(jié)構(gòu)域。

純合Nor-cr1 果實(shí)比野生型果實(shí)成熟晚。平均3天，但令人驚訝的是，成熟過程僅部分受到影響，而自然發(fā)生的突變體則被完全阻斷。純合的Nor-cr1 在60 DPA 時(shí)表現(xiàn)出橘皮現(xiàn)象，表明番茄紅素生物合成受到影響。 Nor-cr1 果實(shí)破壞后的顏色變化比野生型果實(shí)慢得多，并且果皮在DPA > 70 時(shí)仍保持橙色。 Nor-cr1 果實(shí)在Br 和Br+ 5 天階段的乙烯產(chǎn)量顯著低于野生型果實(shí)，這可能是成熟開始延遲的原因，但也可能是由于自發(fā)或乙烯產(chǎn)量顯著較高比突變果實(shí)。在正常的成熟時(shí)間內(nèi)沒有檢測(cè)到乙烯。

alcobaca (alc) 突變編碼NAC 結(jié)構(gòu)域中的有害V106D 取代，是NOR 的等位基因，對(duì)成熟影響較弱。 CRISPR/Cas9 基因替換Yu 等人。在NAC-NOR 編碼序列的第317 位用腺嘌呤替換胸腺嘧啶產(chǎn)生了ALC 等位基因，證實(shí)了ALC 的長(zhǎng)保質(zhì)期特性。三個(gè)Penjar 種質(zhì)包含alc 等位基因，而第四個(gè)包含早期移碼和6 個(gè)氨基酸截短的蛋白質(zhì)，類似于此處描述的Nor-cr1 等位基因。我做到了。我們的Nor-cr1 果實(shí)表現(xiàn)出與alc 果實(shí)相似的延遲成熟和橙色成熟表型。 nor-cr1 的截短蛋白不包含NAC 結(jié)構(gòu)域，可能使nor-cr1 成為真正的無效等位基因。

位于NAC 蛋白C 端區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄激活很重要，與NAC-NOR 相互作用的候選者包括NAC-NOR 本身形成同二聚體，或老化參與此過程的另外兩個(gè)番茄NAC 蛋白包括NAC1 和NAC4。 NAC4 也證明了這種相互作用。 Nor-cr1中乙烯產(chǎn)量的減少證實(shí)NAC-NOR位于乙烯生物合成的上游，并作為具有積極調(diào)節(jié)作用的主調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

自發(fā)突變產(chǎn)生顯性失活蛋白，這些蛋白自發(fā)成熟或以突變體形式成熟。為了方便起見，我們?cè)谶@里將其稱為nor-s。該等位基因被完全阻斷，但在nor-cr1和alc水果中僅部分阻斷。因此，我們假設(shè)nor-s中的不成熟表型是由以顯性失活方式起作用的截短蛋白引起的，其蛋白產(chǎn)物與其他NAC蛋白相互作用并轉(zhuǎn)錄激活它們的靶標(biāo)。 DNA 無需這樣做。

這讓人想起Poplar的NAC TF SND1。選擇性剪接變體保留最終的內(nèi)含子，并且提前終止產(chǎn)生沒有激活結(jié)構(gòu)域但具有幾乎完整的NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該蛋白充當(dāng)其自身和家族成員及其下游靶標(biāo)表達(dá)的顯性失活抑制因子。這表明MADS-rin 等位基因會(huì)阻礙成熟，盡管新形成的RIN-MC 融合蛋白具有rin 敲除菌株中未見的新的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活組合。提醒我。為了進(jìn)一步研究這一點(diǎn)，我們?cè)谧匀话l(fā)生的、突變型和野生型Ailsa Craig 背景中的NOR 自然突變位置的5' 處引入了突變。兩個(gè)等位基因，nor-scr1 和Nor-scr2，分別具有1 bp 缺失和插入，是在天然存在的Nor-s 突變體背景中獲得的，并且在野生條件下獲得了一個(gè)與Nor-scr2 具有相同特征的等位基因。 A 1 bp 插入等位基因(nor-cr2) 由Ailsa Craig 型獲得。

純合Nor-cr2 導(dǎo)致Ailsa Craig 果實(shí)橙皮成熟，純合Nor-scr2 和雙等位基因Nor-scr1/nor-scr2 突變體也是如此。因此，我們可以得出結(jié)論，自然突變的上游移碼阻止了NAC 結(jié)構(gòu)域的翻譯，并廢除了保留完整NAC 結(jié)構(gòu)域的自然突變的顯性失活功能。經(jīng)典的顯性失活TF 仍然與野生型蛋白相同的調(diào)控DNA 元件相互作用或形成相同的二聚體，但雜合二聚體比純合野生型小25%。由于它只是高度活躍，因此表型是： 38.cv 的純合變體與雜合Nor-s 變體比雜合Nor-s 變體更相似。

羅格斯在成熟時(shí)間、胡蘿卜素產(chǎn)生和成熟過程中乙烯產(chǎn)生方面具有中間表型。這表明nor-s的副作用是劑量依賴性的。這表明nor-s是所謂的反式作用顯性失活等位基因，具有位點(diǎn)間相互作用而不是經(jīng)典的位點(diǎn)內(nèi)相互作用，而番茄NAC1 TF和NAC4 TF也具有這種位點(diǎn)內(nèi)相互作用。

盡管FUL1 和FUL2 在果實(shí)成熟過程中具有重疊的功能，但FUL2 在果實(shí)發(fā)育中發(fā)揮著額外的作用。由于番茄FUL1 和FUL2 是相似的旁系同源物，因此RNAi 介導(dǎo)的表達(dá)以特異且有效的方式實(shí)現(xiàn)。擊倒尤其困難，并且其利用也很困難。使用低特異性的RNAi 構(gòu)建體可能會(huì)導(dǎo)致多個(gè)同源基因的敲低。在報(bào)道番茄中FUL 基因敲除的兩項(xiàng)研究中，兩種敲除是同時(shí)實(shí)現(xiàn)的，而在另一項(xiàng)研究中，每個(gè)基因的敲除相對(duì)較弱且不完全特異性。

這些結(jié)果表明FUL1 和FUL2 在番茄果實(shí)成熟中至少部分是多余的，但這兩個(gè)基因的相對(duì)作用尚無定論。因此，我們使用CRISPR/Cas1生成ful2和ful9的單突變體和雙突變體。我們單獨(dú)和組合獲得了FUL1 和FUL2 的多個(gè)敲除等位基因。使用含有兩個(gè)基因的sgRNA 的構(gòu)建體獲得雙突變體。 ful91單突變株含有ful1-cr1等位基因，有1 bp缺失，是由雙鏈斷裂的微同源定向修復(fù)引起的，完全刪除了第二個(gè)外顯子，導(dǎo)致62個(gè)氨基酸裂解。可能產(chǎn)生僅MADS結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)。突變等位基因ful1-cr1 中的1 bp 缺失截?cái)嗔说? 位氨基酸。

兩個(gè)等位基因都廢除了FUL1 功能。在ful1 單突變體中，ful2-cr2 等位基因在MADS 結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)中部插入了1 bp，導(dǎo)致蛋白被截短，只有1 個(gè)氨基酸。 ful1-cr3 等位基因中FUL2 中的2 bp 缺失可以產(chǎn)生除高度保守的MADS 結(jié)構(gòu)域中間的一個(gè)氨基酸（精氨酸2）之外的整個(gè)蛋白質(zhì)。這種突變可能對(duì)蛋白質(zhì)功能有害，Provean蛋白質(zhì)網(wǎng)站的分析進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)（Provean評(píng)分：-25.12），獲得的其他等位基因顯示在補(bǔ)充圖中。我們還檢查了FUL1 和FUL2 的非靶向旁系同源物的相應(yīng)部分的序列。相互但沒有發(fā)現(xiàn)突變，證明了sgRNA的高度特異性。

有趣的是，我們?cè)趂ul2-cr 突變體中觀察到了以前在RNAi 敲除菌株中未報(bào)道過的表型。在果實(shí)發(fā)育的早期階段，純合ful2-cr1果實(shí)在底部呈現(xiàn)出比周圍果皮更淺的表面條紋，但純合ful1-cr1果實(shí)的情況并非如此，并且隨著果實(shí)成熟。其分辨率降低。在兩個(gè)雙突變體ful1-cr2/ful2-cr2和ful1-cr2/ful2-cr3的所有果實(shí)的底部也發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)明亮的色素條紋。僅當(dāng)野生型果實(shí)完全成熟時(shí)，才會(huì)從白色變?yōu)辄S色。這些條紋不僅在表面可見，而且在純合ful1/ful2雙突變體切片的中果皮中也可見，果皮和隔膜的基部區(qū)域的顏色比果實(shí)的其余部分淺得多。

此外，從果實(shí)發(fā)育的早期階段開始，所有ful2 突變體品系（包括雙突變體品系）的表面上都可以看到垂直裂紋，這可能是由于日照造成的。此外，ful2和ful1/ful2果實(shí)的果皮和胎盤即使在果實(shí)完全成熟時(shí)仍保持白色。此外，我們注意到所有攜帶ful2 無效等位基因的突變體的果實(shí)在直徑和高度上都比野生型果實(shí)小10 毫米以上。重量幾乎是野生型果實(shí)的一半，ful2對(duì)成熟開始（Br階段）也有顯著影響。 ful46-cr1的果實(shí)需要一天的時(shí)間才能開花，ful43-cr2的果實(shí)只需要一天的時(shí)間就可以開花。這比野生型果實(shí)明顯短。在兩個(gè)雙突變系中，成熟時(shí)間也顯著短于野生型果實(shí)，但果皮在DPA 達(dá)60 時(shí)仍保持橙色，并且沒有達(dá)到野生型果實(shí)中的紅色成熟顏色。我們推測(cè)ful2突變體較小的果實(shí)尺寸可能與早熟表型有因果關(guān)系，但這需要進(jìn)一步研究。

單突變體和雙突變體對(duì)乙烯產(chǎn)生的累加效應(yīng)表明FUL1 和FUL2 在乙烯生物合成和果實(shí)成熟中的部分冗余功能。這與Bemer 等人證明的淘汰生產(chǎn)線中乙烯產(chǎn)量不變形成鮮明對(duì)比。我們的研究中Ful1/2雙敲除突變體中乙烯水平顯著降低表明FUL1和FUL2通過乙烯生物合成調(diào)節(jié)番茄果實(shí)成熟，這與其他研究一致。研究之間的這些差異可能是由于使用了不同的基因型以及先前分析的RNAi 菌株的有限下調(diào)所致。在這里，我們表明，在ful1/ful2雙突變體中，與nor-cr突變體相似，只有不到三分之一的野生型乙烯產(chǎn)量仍然可以支持某種程度的成熟進(jìn)程；有人提出，存在一個(gè)可用的乙烯數(shù)量有限。最初可能需要乙烯，一旦達(dá)到閾值，成熟就會(huì)開始，即使尚未完全進(jìn)展。

總之，我們已經(jīng)證明了CRISPR/Cas9 誘變?cè)诜�茄中重新評(píng)估轉(zhuǎn)錄因子基因功能的效用。盡管一些表型與之前報(bào)道的非常相似，但可以研究額外的調(diào)控特性，例如轉(zhuǎn)錄的自動(dòng)反饋控制（ap2a）和重翻譯的互補(bǔ)。對(duì)于某些人來說，研究替代等位基因還可以通過分別揭示無效等位基因和顯性失活等位基因（nor-s）之間的差異來更深入地了解基因功能。最后，基因定向誘變使我們能夠分離一對(duì)高度相似的旁系同源物（ful1 和ful2）的功能（或顯示冗余），而使用RNAi 和VIGS 等舊方法很難分離這些旁系同源物。